-
Tối ưu hóa in silico sử dụng các
thuật toán, phương pháp Tin-Sinh học để tăng cường sự phiên mã, dịch mã trên
chủng biểu hiện.
- Gắn
gen mục tiêu lên vector (thuộc thư viện vector biểu hiện pHT) có chứa các trình
tự promoter (như Pgrac01, Pgrac100, Pgrac212, Pspac, …),
Shine-Dalgarno, trình tự đuôi dung hợp nhằm tăng cường sự biểu hiện của protein
mục tiêu trên chủng biểu hiện và trình tự tín hiệu để định hướng phương thức
biểu hiện (nội bào, tiết, bề mặt tế bào, bề mặt bào tử; liên tục hay cần cảm
ứng).
- Các
vector mang gen mã hóa protein mục tiêu được sàng lọc để thu nhận bằng phương
pháp PCR và giải trình tự.
-
Tạo chủng chủ khả nạp (có khả năng tiếp nhận protein mục tiêu). Công nghệ có
hai chủng chủ chính là Escherichia coli và
Bacillus subtilis-một chủng chủ an
toàn không sinh nội độc tố.
-
Biến nạp (đưa vector vào chủng mục tiêu). Vector biểu hiện có thể tồn tại ở
dạng độc lập như plasmid hoặc sáp nhập vào bộ gen của chủng biểu hiện.
- Sự biểu hiện protein tái tổ
hợp của chủng vi sinh vật được xác định bằng SDS-PAGE, Western Blot hay xác
định hoạt tính của protein mục tiêu trên môi trường nuôi cấy lỏng hoặc môi
trường đĩa thach.